دی الکتروفورزیز برای جداسازی ذرات از میکروسیال ها

این مقاله یک طراحی و استراتژی برای یک روش جداسازی جدید ارائه کرده است که در آن از نیروهای دی الکتروفورز فرکانس دوگانه (DEP) برای جداسازی سلول ها یا ذرات در داخل میکروسیال ها استفاده می شود. نیروهای دی الکتروفورز فرکانس دوگانه از طریق تعبیه ی الکترودهای عمودی در دیواره های کانال شکل، ایجاد می شوند. برخلاف جداسازی با روش DEP جزء به جزء جریان میدانی در میکروسیال ها (که در آن، الکترودهای صفحه ای بر روی سطح میکروکانالی مورد استفاده قرار می گیرد و بدین وسیله نیروی DEP موجب به تعادل رسیدن نیروی گرانشی و جدایش اهداف در محل های با ارتفاع مختلف می شود)، جدایش جانبی که بوسیله ی الکترودهای دیواره ای متصل به هم، انجام می شود، برای تولید میدان های الکتریکی غیر یکنواخت و ایجاد نیروی DEP متعادل در طول میکروکانال ها، مورد استفاده قرار می گیرد. در طراحی کنونی، دو میدان الکتریکی AC مجزا به دو گروه از آرایه های الکترودی غیر وابسته و متصل به هم، اعمال می شود. این الکترودها در دیواره های کناری میکروکانال ها، ایجاد می شوند و موجب تشکیل نیروهای DEP افتراقی می شود که در داخل سلول، موجب جریان یافتن سلول یا ذره می شوند. ذرات منفرد نیروهای DEP متفاوتی را تجربه خواهند کرد زیرا خواص دی الکتریک آنها متفاوت است. وقتی آرایه های الکترودی با جریان های سیال برخورد می کنند، تعادل نیروهای DEP افتراقی از آرایه های الکترودی، موقعیت غیر مشابهی نسبت به صفحات تعادلی مجزا در عرض کانال، دارند و از این رو، این مسئله منجر به جدایش جانبی در طول عرض میکروکانال می شود. همچنین ذرات جدا شده، می توانند به طور اتوماتیک به سمت کانال های منشعب شده در مجرای خروجی می شود. این مسئله منجر به ذخیره های افتراقی برای فرایندهای پایین دست می شود. در این مقاله، ما طراحی و تجزیه و تحلیلی درمورد جدایش جانبی با استفاده از DEP فرکانس دوگانه، جدایش سلول/ دانه یا جدایش سلول/ سلول، ارائه کرده ایم. در این روش ها، جدایش جانبی انجام می شود. با استفاده از الکترودهای عمودی بر روی دیواره، ارتفای میکروکانال ها می تواند بدون از بین رفتن میزان قدرت میدان الکتریکی، افزایش یابد. این مسئله برخلاف سایر وسایل DEP فرکانش چندگانه ی مجهز به الکترودهای صفحه ای است. به عنوان یک نتیجه، جمعیت سلولی می تواند به طور همزمان جدا شوند.

مقدمه

دی الکتروفورزیز (DEP) یکی از متداول ترین روش های مورد استفاده برای دستکاری ذرات، سلول ها، ویروس ها، DNA و سایر اجزای موجود در میکروسیال هاست. وسایل تولید شده بر اساس DEP در میکروسیال ها، به طور قابل توجهی برای به دام انداختن، جداسازی، طبقه بندی و شناسایی سلول ها و ذرات مورد استفاده قرار می گیرند. به منظور مینیمم کردن میزان مصرف الکترود در وسایل میکروسیال، موجب شده است تا از نانوذرات یا میکروذرات استفاده شود. آرایه های الکترودی به هم متصل، یکی از متداول ترین پیکربندی های الکترودی مورد استفاده برای روش دستکاری DEP است. با توجه به صنعت مدارهای مجتمع بر پایه ی فرایندهای میکروساخت، که در آن از فرایندهای میکروساخت لایه ی نازک، استفاده می شود، بیشتر پیکربندی های الکترودی DEP از الکترودهای صفحه ای بر روی سطح میکروکانالی استفاده می کنند که نتیجه ی این کار، ایجاد نیروهای DEP در جهت عمودی است. این مسئله مشابه چیزی است که در روش DEP جزء به جزء میدان- جریانی (FFF) مورد استفاده قرار می گیرند (برای جداسازی و طبقه بندی سلول ها). نیروهای DEP که از الکترودهای سطحی موجود در کف، ایجاد می شوند، به طور نمونه وار از سلول هایی مشتق شده اند که در ارتفاهای مختلف کانال، واقع شده اند. برای الکترودهای صفحه ای لایه نازک، همواره فاصله ی مرده ای برای میدان الکتریکی وجود دارد که در بخشی دور نسبت به کف میکروکانال، قرار گرفته اند. نیروی DEP با گرادیان مربع میدان الکتریکی در ارتباط است و با تغییر در ارتفاع کانال، تغییر می کند. کاهش میدان الکتریکی در بخش های بالاتر کانال، موجب کاهش در اثربخشی دستکاری DEP در وسایل میکروسیال با کانال های عمیق می شود.
برای داشتن یک میدان الکتریکی قوی که بتواند کل فضای کانال را پوشش دهی کند، Fiedler و همکارانش از الکترودهای صفحه ای در کف و سر میکروکانال، استفاده کرده اند تا بدین صورت، عملکردهای موازی شدن، قفل کردن و سوتیچینگ را به خوبی انجام دهند. الکترودهای با نسبت طول به قطر بالا که در طول کانال واقع شده اند، همچنین بوسیله ی برخی از گروه های تحقیقاتی تولید شده اند و بدین صورت، این گروه ها توانسته اند نیروی DEF را بهبود دهند. Iliescu معمولاً از الکترودهای سیلیکونی سه بعدی دوپ شده برای دستکاری DEP استفاده می کنند. Voldman و همکارانش وسایل ستونی شکل فلزی و سه بعدی را با روش DEP، تولید کرده اند که بوسیله ی آنها سلول ها را به دام انداختنند. Park و Madou الکترودهای SU-8 کربنی سه بعدی را با استفاده از روش استخراج کربن نانوفیبری از روغن، تولید کردند. یک روش DEP بر پایه ی عایق ها، با استفاده از پست های عایق کاری شده در داخل میکروکانال ها، اجرا کردند که بوسیله ی آن، میدان الکتریکی برای دستکاری نیروی DEP توزیع مجدد شد. این روش برای دستکاری سلولی و جدایش مواد داخل جریان، مورد استفاده قرار گرفته است.
با تغییر در پیکربندی و شکل الکترودها، نیروهای DEP در طول عرض کانال می تواند به اندازه ای بزرگ باشد که ذرات را در جهت موازی با زیرلایه و در جهت عکس جریان، منحرف کند. این مورد برای فلوسیتومتری میکروسیالی مورد استفاده قرار می گیرد و بدین صورت سلول های خاص از کانال های مشخص عبور می کنند. این مورد در واقع یک راه جایگزین برای سوئیچینگ جریان در یک بخش طبقه بندی سلولی فعال شونده با فلئورسنت است. الکترود مسطح ذوزنقه ای و آرایه های الکترودی نقطه ای، به طور پیوسته ذرات با اندازه های مختلف را در کانال های محتوی جریان، جداسازی می کند. Holmes و همکارانش سه جفت الکترود در محل اتصال میکروکانال ها، قرار دادند و بدین صورت یک طبقه بندی دو مسیره از ذرات متمرکز، حاصل می شود.
در روش جداسازی DEP فرکانس چندگانه، از الکترودهای صفحه ای برای تولید نیروهای DEP جانبی برای جداسازی سلول هایی استفاده می شود که در داخل کانال در حال حرکت هستند. این مسئله یا از طریق جفت الکترودهای اتصالی و یا از طریق الکترودهای صفحه ای اتصال یافته، در کانال دسترسی انجام می شود. در کانال اصلی، از الکترودهای مایع برای تزریق جریان به داخل کانال اصلی، استفاده می شود. به هر حال، توان عملیاتی محدود است زیرا ارتفاع این کانال نمی تواند در خارج از جایی وجود داشته باشد که میدان الکتریکی از الکترودهای صفحه ای، ایجاد شوند. علاوه بر این، از آنجایی که الکترودهای صفحه ای همچنین موجب ایجاد نیروهای DEP عمودی بر روی ذرات می شوند، حرکت جانبی ذرات به ارتفاع آنها در کانال، وابسته است و این مورد بر روی دقت جدایش، اثر دارد.
ما قبلاٌ یک فرایند میکروساخت گزارش دادیم که در آن از الکترودهای عمودی در دیواره های میکروکانال ها استفاده می شود و بدین صورت نیروهای DEP جانبی یکنواختی در کل کانال، ایجاد می شود. با وجود الکترودهایی که در تمام ارتفاع کانال، قرار گرفته اند، گرادیان های میدان الکتریکی در طول عرض کانال، می تواند به طور یکنواخت در جهت ارتفاع، تشکیل شود. با این ساختار طراحی و سیگنال های اعمالی مناسب، نیروهای DEP ایجاد شده، برای جداسازی سلول ها و یا ذرات موجود در داخل کانال، استفاده می شود. در واقع این مسئله زمانی انجام می شود که ذرات به صورت جانبی در موقعیت های مختلف کانال و با توجه به موقعیت ارتفاع آنها، قرار می گیرند. این مسئله بوسیله ی ایجاد تعادل در نیروهای DEP بواسطه ی وجود الکترودهای متصل به هم در جهت های مخالف کانال، ایجاد می شود. در این مقاله، ما دو رویه ی جداسازی را ارائه کردیم که بر اساس pDEP/nDEP (پایه های مثبت و منفی برای DEP) و nDEP/nDEP کار می کنند. با استفاده از گروه های مختلف از جفت آرایه های الکترودی، که در طول جهت کانال واقع می شوند، جداسازی می تواند با ترکیبی از نیروهای DEP انجام شود. ذرات می توانند متمرکز شوند و یا به خروجی های مختلف، سوئیچ شوند. این کار به ویژگی های دی الکتریک آنها وابسته است. در این مقاله، آنالیزهای تئوری، شبیه سازی ها و نتایج تجربی، امکان پذیری این روش را به اثبات رسانده است. استراتژی جداسازی مواد موجود در سیال، روش تشخیص، جداسازی و طبقه بندی را با همدیگر، ترکیب کرده است (برخلاف روش سیتومتری) و از یک سیستم لیزر داخلی برای تمیز دادن و سایر استراتژی های سوئیچینگ، استفاده کرده است. با این روش، سلول ها، طبقه بندی می شوند. این استراتژی طبقه بندی جمعیت های سلولی را میسر می سازد، نه طبقه بندی سلول ها به صورت یک به یک. این مسئله موجب می شود تا توان عملیاتی جداسازی، بالا باشد. برخلاف وسایل DEP که در آنها از الکترودهای مسطح، استفاده می شود، الکترودهای عمودی می توانند در طول دیواره قرار گیرند به نحوی که حداقل محدودیت بر روی ارتفاع کانال، قرار دارد. وسایلی که دارای کانال های عمیق و الکترودهای عمودی هستند، دارای توان عملیاتی بالاتری هستند، در حالی که بازده جداسازی، بدون آنکه اثر نیروی DEP از بین رود، حفظ می گردد. DEP ما را قادر می سازد تا بتوانیم سلول های دارای خواص DEP متمایز را بدون لیبل (label-free separation) جداسازی کنیم. علت این مسئله این است که خواص ذاتی DEP مربوط به سلول ها، می تواند برای جداسازی مورد استفاده قرار گیرد و بنابراین، نیاز به اتصال مارکرهای فلئورسنت و یا اتصال آنتی بادی های خارجی از بین می رود. این سلول ها، عموما فنوتیپ (phenotype) و مورفولوژی خود را در طی جداسازی، حفظ می کنند. در نهایت، جداسازی جانبی در این وسیله، نیاز به سایر مکانیزم های جداسازی دیگر را برطرف می کند زیرا در این روش، سلول ها به طور اتوماتیک در خروجی های کانالی مختلف، جریان می یابند. این مسئله موجب می شود تا یکپارچگی با سایر مراحل جداسازی افزایش یابد، زیرا سلول های جداسازی شده، می تواند جریان های پایین دستی را در سایر نواحی چیپ یکسان، مورد تجزیه و تحلیل قرار دهند.

پیش زمینه های تئوری DEP

وقتی ذرات پلاریزه که در یک محیط پراکنده می شوند، تحت میدان الکتریکی غیر یکنواخت قرار گیرند، آنها یک نیروی DEP را دریافت می کنند که به صورت زیر بدست می آیند:

که در اینجا، a شعاع ذره، ε_0 تراوایی فضای آزاد، ε_m تراوایی نسبی محیط، E میدان الکتریکی و φ فاز میدان است. K(w) فاکتور کلازیوس- ماسوتی است که با استفاده از رسانایی ذره و محیط، نفوذپذیری و فرکانس w میدان الکتریکی اعمال شده، بدست می آید. برای یک ذره ی هموژن، فاکتور کلازسیون- ماسوتی، می تواند به صورت زیر بیان شود:

و

که در اینجا، به ترتیب، ثابت دی الکتریک ترکیبی ذره و محیط است. ε و σ به ترتیب، ثابت دی الکتریک و رسانایی ماده است. و همچنین j برابر است با
اولین قسمت فرمول اول، که در واقع بخش حقیقی فاکتور K است که از تغییرات فضایی میدان الکتریکی، بدست می آید. بیشتر انواع دستکاری ها با استفاده از DEP از این تغییر برای تولید اثر DEP استفاده می کنند. عبارت دوم معادله ی اول بوسیله ی تغییرات فازی انجام شده در میدان الکتریکی تعیین می شود و به طور نمونه وار برای آنالیز DEP موجی و آنالیز فضایی چرخش الکتریکی استفاده می شود. اگر تنها از تفاوت فضایی میان میدان های الکتریکی برای کنترل نیروی DEP استفاده شود، از عبارت دوم موجود در معادله ی 1، می توان صرفنظر کرد و بدین وسیله، Re[K] فاکتور تعیین کننده برای نیروی DEP می شود. مقدار این Re[K] بین -1/2 تا 1 متغیر است و به فرکانس های وابسته است که میدان الکتریکی اعمال می کند. Re[K] نیروی DEP مربوطه، می تواند مثت یا منفی باشد. فرکانسی که در آن، Re[K] از منفی به مثبت تبدیل می شود، فرکانس متقاطع (crossover frequency) نامیده می شود. میدان الکتریکی نه تنها مقدار نیروی DEP را به صورت تابعی از ∇E^2تعیین می کند، بلکه همچنین جهتی را تعیین می کند که با تغییر در فرکانس اعمال شده، Re[K] تغییر می کند. طراحی مناسب الکترودها، و انتخاب فرکانس مورد نیاز، موجب می شود تا بتوان نیروهای DEP قابل کنترلی برروی ذرات ایجاد کرد و بدین صورت، آنها را به خوبی، دستکاری کرد.
اگر میکروذرات به عنوان فازهای جامد در نظر گرفته شوند، معادله ی دوم، می تواند برای تشخیص پاسخ فرکانس Re[K] استفاده شود. اگر یک سلول بیولوژیکی به عنوان یک مدل پوسته ای منفرد، تلقی شود، ثابت دی الکتریک ترکیبی سلول به صورت زیر می شود:

که در اینجا، R شعاع سلول و δ ضخامت غشای سلولی است.
شکل 1A نمودار مربوط به Re[K] نسبت به فرکانس های میدان الکتریکی را برای ذرات پلی استایرن 6 میکرونی نشان می دهد و شکل 1B نیز وابسگی فرکانس Re[K] را برای یک سلول مدل سازی شده، نشان می دهد (در این مدل سلول به عنوان یک پوسته ی در نظر گرفته می شود). از آنالیز بالا، این فهمیده میشود که Re[K] مربوط به نیروی DEP می تواند با تغییر در رسانایی محیط و سیگنال الکتریکی اعمال شده بوسیله ی الکترودها، تغییر کند و بدین وسیله، اطمینان حاصل گردد که هدف مورد نظر در محلول، نیروهای DEP مختلفی دریافت می کند و بنابراین، قادر است تا جدایش را انجام دهد. در این مقاله، ما تلاش هایی را گزارش کرده ایم که در مورد استفاده از نیروهای DEP فرکانس چندگانه است که بوسیله ی الکترودهای عمودی متصل به هم در دیواره های کناری، ایجاد شده اند.

اصول جداسازی

شکل 2A نشاندهنده ی یک جدایش نمونه وار FFF-DEP است که در آن، سلول ها یا ذرات مختلف در صفحاتی با ارتفاع مختلف قرار گرفته اند. این ذرات، بواسطه ی متعادل شدن نیروهای DEP و نیروی گرانشی، در طول کانال ها قرار گرفته اند. پروفایل جریان سهموی در کانال حاوی ذرات، سرعت های مختلفی دارد به نحوی که، این ذرت در زمان های مختلف به خروجی می رسند. این نوع از جداسازی، موقتی است و سلول ها، به صورت سریالی در خروجی قرار می گیرند. از آنجایی که وسایل جداسازی DEP میکروسیالی عمدتاً دارای الکترودهای صفحه ای هستند، ذرات یا سلول ها، به صورت عمودی جداسازی می شوند. این روش نیازمند وجود مکانیزم سوئیچینگ دیگر برای اهداف مختلف است تا بدین صورت آنالیز در صورت نیاز مورد بررسی قرار گیرد. جریان جانبی و کناری در میکروکانال ها، می تواند به سهولت ایجاد شود زیرا جریان در این میکروسیال حالت آرم دارد.
داشتن جداسازی سلولی در طول عرض کانال، به آنها اجازه می دهد تا خروجی های کانال را به صورت موازی، اضافه کنیم (شکل 2B). جداسازی جانبی به صورت مستقیم بوسیله ی پروفایل جریان، تحت تأثیر قرار نمی گیرد. و بنابراین، نیازی به وجود کانال های طویل تر برای بهبود بازده جداسازی نیست.
برای حصول جداسازی جانبی، الکترودهای متصل به هم بر روی دیواره ی کانال تعبیه می شوند و این بخش برای تولید یک نیروی DEP در طول جهت عرضی کانال و یک نیروی DEP ثانویه در دیواره ی مخالف، استفاده می شود. جمعیت های سلولی مخلوط، بوسیله ی نیروهای DEP مزدوج در ناحیه ی جداسازی، جدا می شوند و سپس به سمت خروجی های مختلف کانال، جهت دهی می شوند (شکل 2c). نیروی DEP بوسیله ی فرکانس سیگنال و خواص ذرات و محیط، تعیین می شود. با فرکانس های و سیگنال های مختلف، که بوسیله ی گروه های الکترودی مختلف، ایجاد می شوند، فاکتور پلاریزاسیون سلول می تواند به نحوه ای تنظیم گردد که موجب به تعادل رساندن این نیرو در نقاط مختلف کانال می شود. همانگونه که در شکل 2D نشان داده شده است، فرکانس و بزرگی می تواند به نحوه ای تنظیم شود که سلول های سفید را در موقعیت سمت چپ خط مرکزی کانال، داشته باشیم. وقتی یک سلول نزدیک الکترود 1 است، مشابه با نقطه ی A، نیروی DEP (F_1) کاهش می یابد و نیروی DEP دیگر (F_2) افزایش می یابد به نحوی که در نقطه ی C ، این دو نیرو، به تعادل می رسند. در همین حال، سلول های خاکستری رنگ می توانند به گونه ای تنظیم شوند که در موقعیت های سمت راستی خط مرکز جریان، قرار گیرند. بنابراین، این نوع از سلول ها، می تواند به طور اتوماتیک در موقعیت های مختلف قرار می گیرند.

آنالیز و شبیه سازی های تئوری

موقعیت های تعادلی مربوط به یک ذره تحت نیروهای DEP مزدوج، می تواند به صورت زیر بدست آیند: اگر تنها یک عدم یکنواختی فضایی در میدان الکتریکی وجود داشته باشد، بدون آنکه فاز مربوط به میدان تغییر کند ، نیروی DEP می تواند به صورت زیر ساده سازی شود:

برای آرایه های الکترودی به هم پیوسته با عرض الکترود مشابه و شکاف برابر با d، پتانسیل بوسیله ی سری فوریه به صورت زیر است:

که در اینجا،k

وقتی فاصله ی ذرات از الکترودها، بزرگتر از d باشد، گرادیان میدان الکتریکی به صورت زیر ساده سازی می شود:

دو راه وجود دارد که بوسیله ی آن، موقعیت های تعادلی مربوط به ذرات می تواند تغییر کند: تنظیم بزرگی ولتاژ در دو سر آرایه های الکترودی یا تنظیم فرکانس اعمال شده به الکترودها.
وقتی فرکانس مشابه اما ولتاژ متفاوت در دو الکترود ، اعمال شود، نقاط تعادل می توانند به گونه ای تنظیم شوند که به سمت پتانسیل های پایین تر باشند. نقطه ی تعادل بوسیله ی رابطه ی زیر بدست می آید:

که در اینجا، E_1 و E_2 به ترتیب میدان الکتریکی ایجاد شده بوسیله ی دو گروه از الکترودها، می باشند. با جایگزینی معادله ی هفتم در معادله ی هشتم، موقعیت تعادلی می توان به صورت زیر محاسبه شود:

فرکانس های مختلف می تواند همچنین بر روی الکترودهای مختلف اعمال شود تا بدین صورت، موقعیت های تعادلی، تعیین شوند. در این مورد، نیروهای DEP از آرایه های الکترودی چپ و راست، می تواند با تعییر Re[K]، تنظیم شوند. موقعیت تعادلی به صورت زیر بدست می آید:

موقعیت تعادلی برای یک ذره به صورت زیر است

برای دو ذره ی با Re[K] مختلف، آنها موقعیت های تعادلی مختلفی دارند. تفاوت جانبی ویژگی جداسازی است و به صورت زیر بدست می آید:

از رابطه ی دوازدهم، این واضح است که فاصله ی جداسازی جانبی تنها بوسیله ی نسبت Re[K] بدست می آید و نه تنها بوسیله ی استحکام میدان الکتریکی ایجاد شده از دو گروه از آرایه های الکترودی.
شکل 3 نشاندهنده ی توزیع میدان الکتریکی در داخل الکترودهای عمودی به هم پیوسته ای است که در داخل دیواره های CFD-ACE قرار گرفته اند. سیگنال های (10v) و فرکانس با بزرگی یکسان، به هر دو گروه از آرایه های الکترودی به هم پیوسته در آن واحد، اعمال می شود. نواحی نزدیک به الکترودها، همواره دارای استحکام میدان بالاتر هستند، درحالی که نواحی مرکز یا هسته ی کانال، دارای استحکام میدان پایین تری هستند (شکل 3a) ذرات موجود در این نواحی، در زمان نزدیک شدن به دیواره ها، نیروی DEP قوی تری را حس می کنند. بسته به خاصیت دی الکتریک ذره، این ذره می تواند جذب دیواره شود و یا از آن دفع شود. نیروهای DEP می توانند بوسیله ی گرادیان های مربع میدان الکتریکی نیز شاخص باشند (شکل 3B).
یک نیروی DEP در نزدیکی الکترودهای دیواره وجود دارد، در حالی که در خط وسط کانال، نیروی DEP خالص صفر است. برای ذراتی که نیروی pDEP را تجربه می کنند، وسط کانال، یک نقطه ی ناپایدار است که این مسئله بدین معناست که آنها تمایل دارند تا از مرکز کانال، دور باشند زیرا نیروهای pDEP آنها را ب سمت الکترودهای دیواره ای، می کشانند. برای ذراتی که نیروهای nDEP دریافت می کنند، مرکز کانال، یک نقطه ی پایدار است و بنابراین، ذرات در مرکز کانال، متمرکز می شوند. این موقعیت تعادلی می تواند به در هر جایی از کانال، ایجاد شود.
برای دو ذره ای که هر دو، نیروی nDEP دریافت می کنند، در شکل 4 ، اصل جداسازی بوسیله ی اعمال سیگنال های با فرکانس مختلف نشان داده شده است. فاکتور پلاریزاسیون مربوط به این دو ذره یا سلول، می تواند بوسیله ی فرکانس های اعمال شده تنظیم شود به نحوی که آنها می توانند در نقاط تعادلی موجود در کانال قرار گیرند و بدین صورت، در جریان آرام موجود، جاری شوند. نیروی DEP کل مجموعی از دو نیروی DEP است که از دو گروه الکترودی، ایجاد می شوند. وقتی نیروهای DEP از یک گروه از الکترودها، شبیه سازیی می شوند، الکترود دیگر، موجب بروز نیروی DEP در جهت y می شود. این خط در واقع مرز الکترود و دیواره ی کانال است که در شکل 3A نشان داده شده است.
فرکانس های مختلف اعمال شده به الکترودها، موجب ایجاد Re[K] مختلف می شود و هر دو گروه الکترودی، در ولتاژ 10V قرار داده می شوند. وقتی فرکانس های مشابه با Re[K]، یکسان باشد، موقعیت تعادلی خط مرکز کانال است. در این مکان، نیروی DEP صفر است (برای y=50μm و عرض 100μm برای کانال). وقتی فرکانس های مختلف به گروه های الکترودی، اعمال شود، Re[K] مختلف موجب بروز نیروهای DEP مختلف از آرایه های الکترودی راست و چپ می شود. این تعادل می توادن در زیر y=40μm ایجاد شود . یا در بالای خط y=60μm باشد. این مکانیزم تنظیم تعادل بوسیله ی فرکانس، می تواند همچنین برای اهداف سوئیچینگ به خروجی های مختلف، استفاده شود. وقتی دو نوع مختلف از اجسام A و B در این کانال، جاری باشند، جداساز می تواند به طور مناسب انجام شود اگر ترکیب مناسبی از Re[K] وجود داشته باشد.
در شکل 4B، ولتاژها و فرکانس های مختلف به الکترودها اعمال شده است (با اعمال ولتاژ 8V به الکترودهای سمت راستی و ولتاژ 10 V به الکترود سمت چپی). اگر ما فرض کنیم که فرکانس ها بتوانند به طور مجزا از سمت راستس به چپ تنظیم شوند به نحوی که Re[K] برای جسم A برابر با (-0.5,-0.1) و برای جسم B برابر با (-0.1,-0.5) باشد، موقعیت تعادلی مربوط به جسم A در بالای y=70μm و برای جسم B برابر با y=40μm می باشد. جریان موجب می شود تا این دو جسم به خروجی های مختلف، وارد شوند.

روش مورد استفاده

سلول ها در داخل یک محیط با پی اچ ایزوتونیک و رسانایی پایین پراکنده سازی می شوند. این محیط حاوی دکستروز در داخل آب دو بار تقطیر شده است. میکرو ذرات پلی استایرنی که دارای گستره ی اندازه ی 6 تا 15 میکرون هستند، سلول های کلیه ی انسانی HEK293 و سلول های نوروپلاست موش (N115) برای اهداف مورد استفاده برای جدایش، استفاده شده اند. این دو سلول کروی تحت میکروسکوپ، دارای تفاوت های ابعادی مشخص هستند. این مسئله موجب می شود تا بررسی نوری بخش های جداسازی شده، تسهیل شود اگر چه ما منحصراً از این تفاوت اندازه در جداسازی، بهره نبرده ایم. به طور مشابه، سلول های با اندازه ی مشابه و خواص دی الکتریک متفاوت، بوسیله ی DEP متمایز می شوند و باید با دستگاه ما جداسازی شوند. ذرات پلی استایرن، که تحت نیروهای nDEP قرار می گیرند (در کل گستره ی فرکانس)، در اینجا، مورد بررسی قرار گرفته اند. با استفاده از این رویه، سلول های HEK293 و N115 به ترتیب دارای فرکانس های متقاطع نزدیک به 50 و 200 kHz هستند. ابعاد ذرات مورد استفاده در این جداسازی، عبارتست از ارتفاع 40 میکرون، عرض 100 میکرون و طول 550 میکرون. سلول ها و ذرات بوسیله ی پمپ سرنگی پیکوپلاس و با نرخ 0.5 تا 1 میکرولیتر بر دقیقه، جریان یافتند. تمام آزمایشات، در دمای اتاق انجام شده است و ما هیچ مرگ سلولی را در حین اعمال میدان، مشاهده نکردیم.

نتایج و بحث

جداسازی سلول- سلول بوسیله ی DEP مربوط به نیروی جاذبه ی بین مولکولی (pDEP-nDEP)
اگر ذرات و اجسامی که می خواهیم آنها را جداسازی کنیم، در فرکانس های متقاطع، دارای تفاوت های واضح بودند، آنها را می تواند با توجه به نیروهای جاذبه ی بین مولکولی، جداسازی کرد. در این آزمایش، سیگنال فرکانس 100 kHz بر روی الکترودهای سمت راستی اعمال شده است به نحوی که سلول های HEK293 به الکترودها می چسبند و سلول N115 از این الکترودها، دور می شوند . فرکانس 20 kHz با ولتاژهای پایین تر، به آرایه های الکترودی اعمال می شود به نحوی که سلول های HEK293 که در نزدیکی الکترودهای سمت راست قرارگرفته اند، می تواند بواسطه ی nDEP، به سمت وسط کانال حرکت کنند و سپس به واسطه ی pDEP. به الکترود سمت چپ می چسبند. وقتی نرخ جریان به اندازه ی کافی بالا باشد، نیروی هیدرودینامیکی بر روی جاذبه ی حاصله از pDEP در دیواره ی سمت چپ، فایق می یابد و موجب می شود تا سلول های HEK293 به سمت خروجی سمت چپی، انتقال یابند. برای سلول های N115، nDEP حاصله از الکترود راستی، به مقداری کمتر جابجا می شود تا بدین صورت، این ذرات در خط تعادل سمت راست کانال قرار می گیرند و سپس به سمت خروجی راست، جریان می یابند. جداسازی این نوع از سلول ها در شکل 5 نشان داده شده است.

جداسازی سلولی بر اساس nDEP-nDEP

همانگونه که قبلا گفته شد، نیروهای nDEP از هر دو گروه از الکترودهای متصل به هم، می توانند همچنین برای قرار دادن ذرات در مکان های مورد نظر، استفاده شوند. این مسئله موجب می شود تا از تماس ذرات با دیواره، جلوگیری به عمل آید. در واقع برخورد با دیواره موجب چسبیدن ذرات به دیواره می شود. این مسئله همچنین از افزایش غلظت ذرات در ناحیه ی میدان الکتریکی، نیز، جلوگیری می کند. در واقع تمرکز سلولی، موجب آسیب دیدن سلول ها، می شود. نتایج تجربی نشاندهنده ی جداسازی موفقیت آمیز ذرات پلی استایرن و سلول های HEK293 می باشد (شکل 6). برای تأیید سهولت استفاده از نیروهای nDEP مزدوج برای جداسازی، ما با نگهداری این سلول ها در بافر DEP به مدت طولانی، خواص دی الکتریک آنها را به نحوی تغییر دادیم که یکپارچگی غشا تغییر کرده و فرکانس به بالاتر از 1MHz رسید. برای جداسازی سلول یا ذره، هر دو سلول و ذره، نیروهای nDEP دریافت می کنند و به طور پیوسته به کانال های خروجی خاص، جهت دهی می شوند. فرکانس ها و ولتاژ اعمال شده به الکترودهای سمت چپ، به ترتیب 8 ولت و 10 Mhz و الکترودهای سمت راستی به ترتیب برابر با 10 ولت و 50 kHz بوده است. برای ذرات، به دلیل اینکه تغییر در فرکانس، نقش اندکی در تغییر مقدار Re[K] ایجاد می کند، میدان الکتریکی بزرگتری از الکترود راستی نسبت به الکترود چپی ایجاد می شود، به نحوی که نیروهای nDEP قوی تری در این الکترود، ایجاد می شود (به نحوی که موقعیت تعادلی، در سمت چپ بخش مرکز کانال، واقع شده است). برای این سلول ها، Re[K] در فرکانس 10MHz از الکترود چپی، بزرگتر از Re[K] در فرکانس 50 kHz می باشد. این تفاوت در Re[K] بزرگتر از تفاوت مشاهده شده در در میدان الکتریکی برای معادله ی 10 است به نحوی که موقعیت تعادلی سلول که در سمت راست خط مرکزی واقع شده است، با نیروی nDEP بالاتری تحت فشار قرار می گیرد. این مسئله بوسیله ی الکترودهای سمت چپ ایجاد می شود. بنابراین، جریان سلولی به خروجی سمت چپ انتقال می یابد و ذرات به سمت چپ هدایت می شوند (شکل 6a). این شکل همچنین درصد سلول ها و ذراتی را نشان می دهد که در هنگام اعمال نیروهای DEP و در زمان عدم وجود این نیروها در خروجی ها، قرار دارند. با استفاده از نیروهای DEP، تقریباً 100 % از ذرات به خروجی ذره حرکت می کنند، در حالی که بیش از 95 % از سلول ها نیز به خروجی سلول حرکت می کنند. این حقیقت که برخی از سلول ها، به خروجی سلول حرکت نمی کنند، به دلیل تغییر اندک در اندازه و ترکیب غشای آنها می باشد. مرحله ی سیکل سلولی، همچنین اثر خواص دی الکتریکی سلول را دست خوش تغییر می کند. در مقایسه با سلول ها، ذرات نسبتاً هموژن ترند و از این رو، بهتر جداسازی می شوند.

بحث

ما به صورت تئوری و عملی نشان دادیم که وسایل میکروسیالی که مجهز به الکترودهای به هم متصل عمودی هستند، می توانند برای تولید نیروهای DEP مختلف بر روی ذرات استفاده شوند که در میکروکانال ها در حال حرکت هستند. اگر چه فاصله ی جداسازی میان ذرات مختلف، تنها بوسیله ی نسبت Re[K] تعیین می شوند، موقعیت های تعادلی ذرات در میکروکانال ها، هنوز تحت تأثیر بزرگی دو میدان الکتریکی است که موقعیت جانبی را تعیین می کنند (همانگونه که از مدل آنالیز، این مسئله فهمیده می شود). همانگونه که از آزمایش های جداسازی انجام شده با استفاده از nDEP فهمیده می شود، ولتاژ تفاضلی دو گروه از الکترودها، برای تنظیم موقعیت ذره در سمت چپ کانال، استفاده می شود. با تنظیم ولتاژ و فرکانس، می توان موقعیت جانبی ذره و فاصله ی جداسازی مناسب میان ذره را تعیین نمود.
DEP با فرکانس چندگانه، می تواند برای طبقه بندی ذرات استفاده شوند. نتایج شبیه سازی و تحلیلی نشاندهنده ی سهولت استفاده از این روش برای جداسازی با الکترودهای به هم متصل می باشد. در کارهایی که قبلا انجام شده است، از الکترودهای مایع عمودی برای تولید نیروهای DEP جانبی استفاده شده است. تمرکز این تحقیقات بر روی جداسازی ذرات و سلول ها بوده است. در حالی که در این روش، اجزای DEP عمودی در کانال های کم عمق حدف می شوند، این روش دارای محدودیت هایی است زیرا میدان الکتریکی به سرعت و در عمق کانال، افت می کند. طراحی ما، موجب بهبود میدان الکتریکی می شود که به جسم برخورد می کند. بیشتر روش های جداسازی DEP فرکانس چندگانه ای که مورد بررسی قرار گرفته اند، تنها به سلول هایی اجازه ی جداسازی می دهد که نیروی DEP را به خوبی دریافت می کنند. این مسئله در زمانی مشکل آفرین است که سلول های بسیاری درداخل این کانال، جریان می یابند. در کانال های عمیق با الکترودهای مسطح، نیروی DEP جانبی با تغییر عمق کانال، تغییر می کند. علت این مسئله افت میدان با تغییر فاصله از سطح الکترود می باشد. میکرووسایل دارای الکترودهای عمودی، که در آنها، این الکترودها در طول دیواره ی مربوط به میکروکانال، واقع شده اند، نیروهای DEP جانبی یکنواخت تری ایجاد می کند این مسئله در زمان استفاده از کانال های عمیق تر، حیاتی است.

نتایج بدست آمده

یک وسیله ی جداسازی میکروسیالی DEP ، وسیله ای دارای میکروالکترودهای به هم متصل است که در دیواره میکروکانال ها، واقع شده اند. این وسایل مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است. الکترودهای عمودی به هم پیوسته، که در دیواره های قرار داده می شوند، موجب ایجاد نیروهای DEP جانبی در عرض کانال می شود و یکنواختی این میدان در ارتفاع کانال، بالاست. نیروهای DEP ایجاد شده از الکترودهای موجود در دیواره ی کانال، می تواند به تعادل برسد و همچنین مزدوج گردد. تحت اثر نیروهای nDEP مزدوج، ذرات می توانند در هر موقعیت تعادلی قرار گیرند. وقتی این ذرات که دارای خواص DEP متفاوت است، وارد کانال شوند، نیروی DEP می تواند با تغییر فرکانس و میزان سیگنال های اعمال شده بر روی الکترودها، تغییر کنند، به نحوی که این ذرات می توانند در موقعیت های مختلف نسبت به عرض کانال، قرار گیرند و در نتیجه، به خروجی های مختلف، هدایت شوند. نتایج تجربی نشاندهنده ی سهولت جداسازی با این استراتژی است. با استفاده از الکترودهای تعبیه شده در دیواره های میکروکانال، ارتفاع این کانال می تواند به گونه ای تنظیم شود که اجازه داده شود تعداد زیادی از سلول ها، از بخش جداسازی عبور کنند، بدون آنکه میزان بازده فرایند جداسازی، افت کند. این سیستم جداسازی دارای جریان پیوسته، قادر است تا میکروسیال ها را به خوبی طبقه بندی کند و می تواند به طور کامل عملکرد یک سیتومتری جریانی معمولی را داشته باشد. این استراتژی جداسازی، با سایر مراحل آماده سازی میکروسیالی تطابق دارد و قابلیت عبور دهی پیوسته ی سیال را نیز دارد. این کار میزان نیروی انسانی مورد نیاز برای این کار را به حداقل می رساند.